Вагинальный биоценоз представляет сложную динамическую систему, находящуюся в каждый отдельный момент времени в равновесном состоянии, обусловленном множеством эндогенных и экзогенных факторов (следует уточнить, что понятия нормы и равновесия не являются тождественными).
Наиболее значимыми факторами являются возраст, репродуктивное поведение, акушерско-гинекологический анамнез, гормональный статус, использование гормональных и антибактериальных препаратов, наличие экстрагенитальной патологии. Также следует учитывать влияние на женщину социальных и культурных факторов, таких как национальные традиции, реклама средств интимной гигиены и мода на ношение тесной обтягивающей одежды, интимный пирсинг и другие травмирующие косметические процедуры в области гениталий, которые существенно изменили представление самой женщины о норме применительно к состоянию вульвы и влагалища. Широкое распространение приобрела практика самостоятельного применения вагинальных антисептических, антибактериальных и антимикотических средств.
Тем не менее понятие нормы применительно к биоценозу влагалища — это медицинская категория, основанная прежде всего на четких представлениях о количественном и качественном составе вагинальной микрофлоры [1], а современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют получить на сегодняшний день максимально полное и объективное представление о всех участниках вагинальной биоты.
Для клинического применения молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики необходимо определение нормальных и патологических характеристик вагинальной экосистемы у различных групп женщин. В силу разнообразных медико-социальных причин именно формирование группы клинически здоровых женщин вызывает наибольшие затруднения для акушеров-гинекологов и венерологов.
Целью настоящего исследования явилось изучение вагинального биоценоза с помощью метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста и женщин в перимепопаузе и постменопаузе.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 604 женщины в возрасте от 17 от 73 лет. В 1-ю группу вошли 230 небеременных женщин репродуктивного возраста — от 26 до 36 лет, обратившихся к гинекологу с целью профилактического осмотра или предгравидарной подготовки. Во 2-ю группу вошли 283 беременные женщины в возрасте от 25 до 33 лет, из них 140 женщин были обследованы в I (72 женщины планировали беременность вынашивать, 68 — прерывать), 50 — во II и 93 — в III триместре беременности. В исследование были включены женщины, у которых при микроскопии вагинального отделяемого лейкоциты выявляли в количестве от 0 до 5 клеток в поле зрения, флора была представлена преимущественно лактоморфотипами [2]. В 3-ю группу были включены 65 женщин в перименопаузе в возрасте от 48 до 52 лет. В 4-ю группу вошли 26 женщин в постменопаузе в возрасте от 57 до 60 лет.
Критериями включения в исследование являлись отсутствие жалоб на патологические выделения, дискомфорт в области вульвы и влагалища. Критериями исключения являлись следующие параметры: клинические признаки вагинита или бактериального вагиноза, выраженная лейкоцитарная реакция в вагинальном отделяемом, признаки воспалительного процесса во влагалище.
Исследование биоценоза влагалища проводи-ли методом ПЦР-РВ с использованием реагента «Фемофлор» (производитель: ООО «НПО ДНК-Технология», РУ ФСР 2009/04663, патент № 2362808 от 13.02. 08). Материал для исследования собирали с заднебоковой стенки влагалища на предметное стекло и в пробирку Эппендорф, содержащую 1 мл физиологического раствора. Хранение и транспортировку материала проводили согласно действующим нормативным документам. Микроскопию препаратов, окрашенных по Граму, осуществляли при увеличении в 1000 раз. При этом оценивали количество лейкоцитов и характер микрофлоры. Для исследования биоценоза влагалища выделяли ДНК микроорганизмов с использованием набора реагентов «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология»), а ПЦР-РВ проводили в амплификаторе ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология») согласно инструкции производителя. С помощью специального программного обеспечения рассчитывали количество (в геном-эквивалентах/ мл — гэ/мл) общей бактериальной массы (ОБМ), лактобацилл и каждой группы условно-патогенных микроорганизмов. Дополнительно оценивали долю нормофлоры, факультативно-анаэробных микроорганизмов и анаэробных микроорганизмов в процентах среди всех выявленных бактерий.
Статистическую обработку данных проводили с помощью статистического пакета SPSS Statistics версии 17.0 (Inc., Chicago, USA). В качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана, а в качестве интервальной оценки — верхний и нижний квартили, так как исследуемые выборки не подчиняются закону нормального распределения.
Результаты исследования и обсуждение
Результаты исследования вагинального биоценоза, полученные методом ПЦР-РВ, интерпретировали следующим образом. Наличие более 90% лактобактерий в ОБМ, менее 10% условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов, абсолютное количество грибов рода кандида и микоплазм, не превышающее 104 гэ/мл, расценивали как нормоценоз [4,5]. Как относительный нормоценоз рассматривали вариант биоценоза, при котором на фоне высокого содержания лактобактерий (более 90% от ОБМ) были выявлены микоплазмы или грибы рода Candida в количестве 104 гэ/мл и более [3]. При умеренном снижении доли лактобактерий (от 20 до 90% от ОБМ) и увеличении доли аэробов или анаэробов делали заключение об умеренном аэробном дисбалансе или умеренном анаэробном дисбалансе соответственно. Если доля лактобактерий составляла менее 20% от ОБМ при резком увеличении доли анаэробов, такое состояние расценивали как анаэробный дисбаланс, при увеличении доли аэробов — аэробный дисбаланс.
ОБМ и количество лактобактерий у небеременных женщин репродуктивного возраста колебались в достаточно широких пределах — от 105,4 до 108,5 (табл. 1).Тем не менее доля лактобактерий от общего количества выделенных бактерий у 90% обследованных женщин составляла от 55,5 до 99,9% (медиана равна 99,6%). Количество аэробных и анаэробных микроорганизмов отличалось от количества лактобактерий более чем на 2 порядка, а их доля составляла 0,03 (0,0008–3,1)% и 0,26 (0,006–38,0)% от суммы всех выделенных микроорганизмов соответственно.
Наиболее высоких значений достигает количество двух групп микроорганизмов: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. и Eubacterium spp. (рис. 1)). У абсолютного большинства женщин эти микроорганизмы обнаружены в количестве от 102 до 105 гэ/мл. При этом у 14,3% женщин количество Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. превышало 105 гэ/мл. У 20,9% женщин были выявлены Eubacterium spp. в количестве более 105 гэ/мл. Atopobium vaginae, который рассматривают как маркер бактериального вагиноза наравне с Gardnerella vaginalis, выявляли во влагалище клинически здоровых женщин гораздо реже, чем микроорганизмы из группы Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/ Porphyromonas spp. У 30% женщин Atopobium vaginae не обнаружен и у остальных присутствовал в меньшем количестве (медиана 102 гэ/мл по сравнению с 103,7 гэ/мл соответственно). Лишь у 5,2% женщин количество Atopobium vaginae было 104 гэ/мл и выше. По-видимому, наличие Atopobium vaginae, менее характерно для клинически здоровых женщин по сравнению с Gardnerella vaginalis.
В 1-й группе нормоценоз выявили у 25,8% женщин, относительный нормоценоз — у 63,9% женщин (рис. 2). На долю выраженного анаэробного дисбаланса пришлось 0,5% случаев, в 4,6% случаев выявили умеренный анаэробный дисбаланс, в 3,6% — умеренный аэробный дисбаланс. Среди женщин с относительным нормоценозом в 18,5% случаев была обнаружена уреаплазма в количестве более 104, в 66,9% — Candida spp., в 14,6% — одновременно выявили уреаплазму и кандиду (рис. 3).
Среди всех клинически здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста у 21,1% были выявлены уреаплазмы в количестве более 104. С одной стороны, полученные данные подтверждают точку зрения многих исследователей о возможности персистенции уреаплазм в количествах, превышающих диагностические, во влагалище клинически здоровых женщин. С другой стороны, неизвестно, насколько устойчиво состояние относительного равновесия вагинального биоценоза при наличии в составе его уреаплазм в больших количествах. Требует изучения вопрос о влиянии различных эндогенных и экзогенных факторов на изменения биоценоза с развитием патологических симптомов.
Микоплазмы, в отличие от уреаплазм, практически отсутствовали во влагалище здоровых женщин.
Грибы рода Candida в количестве более 103 гэ/мл выявили у 52% женщин 1-й группы. Кандиды существуют в тех же условиях, что и лактобактерии, они не чувствительны к изменению рН и не конкурируют с нормофлорой, поэтому их интенсивное размножение не приводит к уменьшению количества лактобактерий. Исследование показало, что у части женщин присутствие этого микроорганизма в значительных количествах не приводит к появлению симптомов урогенитального кандидоза. Таким образом, интерпретацию результатов метода ПЦР-РВ необходимо проводить очень осторожно, важно учитывать клинические данные конкретной пациентки.
Во 2-й группе (беременные женщины) нормоценоз выявили у 36,3% женщин, относительный нормоценоз — у 59,8% женщин (рис. 4). На долю анаэробного дисбаланса пришлись 0,5% случаев, в 3,4% случаев выявили умеренный анаэробный дисбаланс. Структура относительного нормоценоза у беременных женщин практически не отличалась от таковой у небеременных. В 18,2% случаев относительный нормоценоз при беременности был обусловлен присутствием уреаплазм в диагностическом количестве, в 59,9% — Candida spp., в 21,9% одновременно выявляли уреаплазму и кандиду.
ОБМ у 90% обследованных беременных женщин находилась в диапазоне от 106,6 до 108,5, причем лактобактерии составляли 99,8% от суммы выделенных бактерий (табл. 2). Количество аэробных и анаэробных микроорганизмов отличалось от количества лактобактерий на несколько порядков, доля их составляла 0,027 и 0,26% соответственно.
Мы не нашли статистически достоверных различий в состоянии биоценоза влагалища у беременных и небеременных женщин. Это позволяет предположить, что качественный и количественный состав микрофлоры влагалища у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста значимо не меняется во время беременности. Во влагалище клинических здоровых женщин репродуктивного возраста лактобактерии составляют более 99% от суммы всех определяемых микроорганизмов (табл. 3).
В период угасания репродуктивной функции и в менопаузе экология влагалища претерпевает значительные изменения, обусловленные прежде всего снижением уровня эстрогенов в организме женщины. В результате уменьшается содержание гликогена в клетках вагинального эпителия и снижается численность лактобактерий. Таким образом, изменение условий существования микроорганизмов вызывает изменение количественного и качественного состава микрофлоры влагалища. В связи с применением стандартного подхода в интерпретации результатов исследования биоценоза влагалища методом ПЦР-РВ у большинства женщин в перименопаузе и менопаузе были получены патологические варианты заключений (рис. 5).
Абсолютный нормоценоз выявили только у 10,7% женщин 3-й группы (перименопауза) и у 15,4% женщин 4-й группы (постменопауза). Относительный нормоценоз выявили у 21,5 и 11,5% женщин 3-й и 4-й группы соответственно. Таким образом, неприемлема интерпретация состояния биоценоза влагалища у женщин старшей возрастной группы с позиции нормы, характерной для женщин репродуктивного возраста.
Сведения о количестве отдельных микроорганизмов в составе биоценоза влагалища у женщин 3-й группы представлены в табл. 4, из которой видно, что у женщин в перименопаузе снижена ОБМ. Количество лактобактерий в составе биоценоза также меньше и отличается от ОБМ в 10 раз. Увеличилось количество анаэробов, преимущественно за счет Gardnerella vaginalis и Eubacterium spp. Количество уреаплазм и Candida spp. сопоставимо с таковым у женщин репродуктивного возраста.
По мере углубления менопаузы ОБМ продолжала снижаться, уменьшались абсолютное количество лактобактерий и их доля в составе биоценоза, происходило замещение лактобактерий анаэробными микроорганизмами. Практически отсутствовали уреаплазмы и микоплазмы, что, возможно, связано с изменившимися условиями существования. Грибы рода Candida выявлены преимущественно в количестве менее 103 гэ/мл.
В табл. 5 представлены сведения о количестве отдельных микроорганизмов в составе биоценоза влагалища у женщин в постменопаузе (4-я группа, n=26).
В табл. 6 и табл. 7 представлены сведения о доле лактобактерий, аэробов и анаэробов относительно суммы выделенных микроорганизмов у женщин в перименопаузе и постменопаузе.
Представленные данные свидетельствуют о том, что в постменопаузе происходит значительное вытеснение лактобактерий с заменой их преимущественно анаэробными микроорганизмами (рис. 6). Кроме того, значительную роль начинают играть аэробные и смешанные аэробно-анаэробные микробные ассоциации. Отсутствие клинических признаков воспалительного процесса во влагалище женщин, обследованных в перименопаузе и постменопаузе, позволяет предположить, что такой вариант биоценоза может быть возрастной нормой.
В течение всего репродуктивного (18–45 лет) возраста у женщин ОБМ сохраняется на уровне 107–108, с наступлением перименопаузы количество бактерий во влагалище начинает достоверно уменьшается и у большинства женщин определяется на уровне 106–107,5 (р<0,001). У женщин к постменопаузе этот показатель продолжает снижаться и достигает 105–106.
Количество лактобактерий, определяемое на уровне 107–108 у большинства женщин репродуктивного возраста, в перименопаузе и постменопаузе снижается до нуля у трети женщин, еще у трети количество лактобактерий находится на уровне 102–103.
Энтеробактерии в менопаузе не встречаются в количествах, превышающих 103, в то время как у 10% женщин 1-й и 2-й группы эти микроорганизмы определяют в количестве 104–105. Варианты биоценоза, когда энтеробактерии не были обнаружены совсем, были выявлены в единичных случаях у женщин в I тримеcтре беременности. Во всех остальных случаях эта группа микроорганизмов присутствовала в составе биоценоза влагалища.
Максимально определяемое количество стафилококков при менопаузе не превышало 103, у женщин с атрофией — 102. В то же время у женщин репродуктивного возраста, как беременных, так и небеременных, определяли более высокие количества стафилококков. В единичных случаях стафилококки полностью отсутствовали в составе биоценоза, как у женщин репродуктивного возраста, так и в менопаузе.
Анализ участия группы анаэробов в формировании вагинального биоценоза выявил следующие закономерности. Микроорганизмы, относящиеся к группам G.vaginalis spp., Eubacterium spp., Mobiluncus spp., Clostridium spp., выявлены у большинства женщин всех групп. Более высокие значения характерны для G.vaginalis spp. и Eubacterium. У женщин репродуктивного возраста частотное распределение этих микроорганизмов по абсолютному количеству не различалось для беременных и небеременных. Почти у 5% небеременных женщин репродуктивного возраста выявлены Eubacterium spp. и Gargnerella в количестве 106, другие анаэробы в таких количествах не обнаруживали. В менопаузе Eubacterium sрр. выявлены у всех женщин, в то время как Gargnerella в 20% случаев отсутствовала. В менопаузе достоверно увеличивается доля женщин, у которых обнаруживали Eubacterium spp. и Gargnerella в количестве 106—107. Mobiluncus spp. присутствовали у всех женщин во время беременности и в менопаузе, и только 5% женщин 1-й группы не являлись носителями этого микроорганизма. Доля женщин с низким уровнем Mobiluncus spp. (102–103) увеличивается в менопаузе, что может быть связано с уменьшением ОБМ.
Clostridium spp. и Peptostreptococcus spp. встречаются у большинства женщин репродуктивного возраста и в менопаузе в умеренных количествах (102–104). Megashpaera spp. выявляли реже описанных выше групп анаэробов у женщин всех трех групп, у 25 женщин 1-й группы этот микроорганизм отсутствовал. У большинства женщин репродуктивного возраста Megashpaera spp. присутствовала в незначительных количествах (102–103). В менопаузе увеличивается доля женщин — носителей этого микроорганизма, в том числе больше доля женщин, у которых Megashpaera spp. обнаружены в количестве до 106.
Atopobium vaginae у женщин репродуктивного возраста выявлен в небольших количествах (102–103), причем у небеременных женщин его обнаруживали в 2 раза реже, чем у беременных. У 5% женщин в I триместре беременности этот микроорганизм определяли в количестве от 4,1 до 4,8 lg, у 16% женщин в I триместре Atopobium vaginae отсутствовал. По мере увеличения срока беременности увеличивалась доля женщин, у которых не выявляли этот микроорганизм, достигая во II триместре 19%, а в III — 30%. У 79% женщин во II триместре беременности и у 70% женщин в III триместре Atopobium vaginaе присутствовал в количествах менее 103. У 58% женщин 3-й группы (перименопауза) и у 78% женщин 4-й группы (постменопауза) этот микроорганизм отсутствовал. Однако в случае выявления атопобиума у женщин 3-й и 4-й групп превалировали высокие количества – 104–106.
Микоплазма оказалась редкой находкой у женщин всех групп. Обнаружение ее в единичных случаях и в незначительном количестве характеризует микоплазму как редкого участника вагинального биоценоза у клинически здоровых женщин. У женщин 2-й группы (беременных) этот микроорганизм выявили в 12% случаев, у большинства из них количество микоплазм не превышало 102 гэ/мл.
Уреаплазмы обнаружены у женщин всех групп. Во всех группах доля женщин, у которых количество уреаплазм превышало 104, была значительной. В том числе уреаплазмы выявлены у 58% беременных. Доля женщин, у которых количество уреаплазм было более 104, в I триместре составила 22,8%, во II — 23,2%, в III — 16,2%.
Грибы рода Candida присутствовали у большинства обследованных женщин всех групп в количествах более 103. У 10% женщин репродуктивного возраста грибы выявляли и в более значительных количествах — 104—105. Аналогичные данные были получены и в группе беременных: в количестве более 104 гэ/мл грибы рода Candida были обнаружены у 10,7% женщин в I триместре, у 9,3% женщин во II триместре и у 8,1% — в III. У женщин в перименопаузе грибы рода Candida в количестве более 104—105 были обнаружены в 9,2% случаев, а в постменопаузе — в 7,6% случаев. Полученные данные требуют коррекции существующих представлений о допустимых количествах грибов рода Candida в составе биоценоза влагалища с учетом высокой аналитической чувствительности метода. Таким образом, современный молекулярно-биологическй метод ПЦР-РВ с использованием реагента «Фемофлор» является чувствительным инструментом для исследования биотопа влагалища. Изученные группы микроорганизмов участвуют в формировании вагинального биоценоза женщин разного возраста независимо от состояния репродуктивной системы. Данные исследования, проведенного с помощью молекулярно-генетических методов, не противоречат существующим представлениям о структуре вагинальных биоценозов, значительным образом дополняя наши представления о качественном и количественном составе микробиоты. Высокая чувствительность метода позволяет идентифицировать даже незначительные количества микроорганизмов, составляющих биоценоз.
Определяющей характеристикой нормального биоценоза является количественное взаимоотношение между нормальной флорой (лактобактериями) и условно-патогенными микроорганизмами, которое в репродуктивном возрасте определяется доминированием лактофлоры, а в перименопаузе и постменопаузе — преобладанием анаэробной флоры.
Применение молекулярно-генетических методов для выявления Atopobium vaginae показало, что данный микроорганизм, в отличие от Gardnerella vaginalis, чрезвычайно редко является компонентом нормального биоценоза.
В биоценозе влагалища клинически здоровых женщин всех групп в незначительном количестве могут присутствовать облигатно-анаэробные микроорганизмы. Факультативно-анаэробные микроорганизмы (такие как стафилококки и стрептококки) встречаются гораздо реже, чем облигатно-анаэробные микроорганизмы.
У каждой пятой женщины репродуктивного возраста выявлена уреаплазма в количестве более 104 гэ/мл. У 10% женщин репродуктивного возраста без клинических признаков дисбиотических процессов во влагалище были обнаружены дрожжеподобные грибы в количестве более 104 гэ/мл. Учитывая отсутствие каких-либо клинических признаков воспаления или дискомфорта, данное состояние можно рассматривать как вариант нормального биоценоза. Вопросы стабильности во времени и устойчивости к внешним воздействиям такого биоценоза требуют дополнительного исследования.
