Ежегодно примерно у 70 миллионов супружеских пар в мире диагностируется бесплодие [1]. С момента первого успешного опыта рождения ребенка, зачатого в пробирке, в 1978 г. вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) получили широкое распространение как в развитых, так и в развивающихся странах. Одновременно с этим накапливается значительная информация, свидетельствующая о более негативных исходах беременностей, индуцированных при помощи ВРТ, по сравнению с таковыми при естественном оплодотворении. Результаты, полученные в ходе систематических исследований и мета-анализа данных, свидетельствуют об увеличении риска преждевременных родов, рождении детей с низким весом и синдромом задержки развития в группах беременных после ВРТ [1]. Несмотря на совершенствование методов экстракорпорального оплодотворения, до сих пор не ясно, на каком этапе беременности возникает этот риск, каков вклад периимплантационных факторов и насколько эти факторы влияют на здоровье ребенка и взрослого человека после рождения.
В настоящее время доказано, что риск возникновения сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний определяется не только укладом жизни и генетической предрасположенностью, но может быть запрограммирован особенностями внутриутробного развития. Ретроспективные исследования, проведенные проф. Дэвидом Баркером и его коллегами (Англия) в 80-х годах прошлого века, показали каузальную связь между нарушением внутриутробного питания плода (суррогатным показателем которого является вес при рождении) и увеличением вероятности развития артериальной гипертензии, диабета 2-го типа в последующей жизни [2, 3]. Многочисленные эпидемиологические исследования, проведенные затем во многих странах мира, подтвердили зависимость между субоптимальным ростом плода и увеличенным риском развития диабета 2-го типа, гипертензии, дислипидемии, атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний в последующей жизни [4]. Важно подчеркнуть, что развитие кратковременных и долгосрочных эффектов (или, как впоследствии назван был этот процесс, программирование заболеваний) зависели от того, в какой момент развития беременности наступило нарушение питания плода и какова его природа.
В контексте изложенного большой материал для размышлений дало изучение последствий так называемой «голландской голодной зимы». Оказалось, что у женщин, голодавших в первую половину беременности, родились дети с высоким риском развития сердечно-сосудистых заболеваний во взрослом возрасте [5, 6]. В то же время у матерей, которые застали начало голода во второй половине беременности, родились дети с низкой массой тела, склонные впоследствии к ожирению [6, 7].
В экспериментальных работах на животных было показано, что ограничение питания по содержанию белка в начале беременности коррелировало с меньшим весом плаценты и массой новорожденного, а подобное воздействие во второй половине беременности приводило к рождению потомства с уменьшенным количеством подкожно-жирового слоя [8]. На животных моделях было установлено, что ранние стадии развития беременности были особенно чувствительны к ограничению поступления белка с пищей [8]. Раннее ограничение питания овец приводило к изменениям функции сердечно-сосудистой системы, уровня циркулирующего кортизола у плодов и развитию гипертрофии сердечной мышцы у ягнят в последующей жизни [9, 10]. Более того, результаты экспериментов на мышах показали, что ограничение поступления белка к матери имеет значение не только во время беременности. Если это ограничение начиналось в преконцепционный период и продолжалось в течение беременности, то изменения сердечно-сосудистой системы (гипертензия) были еще более выражены [11]. В исследованиях на крысах было показано, что ограничение белка в диете, даже если оно имело место только в преконцепционный период, уже было способно «программировать» гипертензию у взрослого потомства [12].
Генетика и эпигенетика внутриутробного развития
В ходе международного проекта «Геном» было идентифицировано около 30 тысяч генов человека. Однако в ходе внутриутробного и постнатального развития экспрессируется только 6 тысяч генов. Остальные 24 тысячи представляют собой своеобразный генетический резерв, который может быть реализован при изменении условий существования организма во внутриутробный период и после рождения. То, какие гены и в какой последовательности могут быть экспрессированы, находится в значительной мере под контролем так называемых эпигенетических (дословно надгенетических) факторов. К числу этих факторов относятся уровень снабжения плода кислородом, потоки питательных веществ, физические и химические составляющие внутренней среды и окружения плода.
Эпигенетическое влияние на геном заключается в изменении специфической «упаковки» хроматина, что приводит к экспрессии, либо депрессии данного гена. Это означает, что эпигенетические факторы способны влиять на состояние специфических фрагментов ДНК без изменения нуклеотидной последовательности самой молекулы. Это свойство лежит в основе феномена, когда при наличии одного генотипа возможно получение разных фенотипов [13]. У млекопитающих такие модификации допустимы при метилировании сериновых остатков в гистоне [14]. Во время гаметогенеза и преимплантационного развития геном млекопитающих проходит интенсивную эпигенетическую реорганизацию для достижения оптимального состояния экспрессии различных генов, необходимого для дифференциации и синтеза белков, специфичных для разных тканей [15]. В экспериментах in vivo и in vitro было показано, что факторы окружающей среды способны существенно влиять на эпигенетическое ремоделирование, имеющее место в ходе раннего эмбрионального периода, меняя состояние метилирования гистонов. Именно эти изменения модулируют экспрессию генов и, в конечном итоге, состояние здоровья потомства [16].
Воздействия на гаметогенез
Гаметогенез млекопитающих – высокоорганизованный во времени процесс реализации определенных событий, проявляющийся в дифференциации и продуцировании высоко специализированных гаплоидных гамет. Однако, несмотря на центральную роль гаметогенеза в репродукции и развитии, механизмы, регулирующие этот процесс, до сих пор далеко не изучены. В экспериментах как in vitro, так и in vivo гаметы, как правило, оказываются в нефизиологических условиях, что само по себе может влиять на состояние потомства и существенно снижать возможности адекватной интерпретации результатов экспериментов.
Оогенез млекопитающих продемонстрировал свою чувствительность к условиям окружающей среды, таким образом, экспрессия генов оплодотворенной яйцеклетки и бластоцисты может быть изменена [17]. В экспериментах на культуре ооцитов in vitro и в экспериментах с ограничением белка в рационе матери было продемонстрировано, что дифференциация, развитие и созревание яйцеклеток меняются [18, 19]. Это может иметь существенное влияние на состояние здоровья потомства. Подобная зависимость имеется не только у грызунов, но и у домашних животных (овец), что позволило скотоводам вывести эмпирическую зависимость между питанием матери до зачатия, в различные периоды беременности и массой тела новорожденных [20]. Также было показано воздействие диеты на морфологию, объем и состав фолликулярной жидкости у овец [21].
Однако не всегда дефицит белка в пище является негативным фактором. Иногда эту роль играет избыток белка. Было показано, что превышение нормы содержания белка в пище и, соответственно, увеличение концентрации в крови мочевины приводит к увеличению содержания этого вещества в фолликулярной жидкости и замедлению развития бластоцисты [22].
У мышей значительное уменьшение клеточной массы бластоцисты было показано при кормлении самок, в течение нескольких недель до оплодотворения, диетами как обедненными по белку, так и обогащенными сверх нормы [23]. Одновременно с уменьшением количества клеток бластоцисты сами клетки демонстрировали увеличение числа специфических маркеров метаболического стресса [24]. Преконцепционное уменьшение питания овец приводило к увеличению артериального давления у плодов, влияло на динамику роста плаценты и самого плода, а также увеличивало активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы [25]. Кормление овец в преконцепционный период диетой с уменьшенным содержанием витаминов группы В и метионина (веществами, необходимыми для функционирования цикла метилирования) способствовало рождению ягнят большего веса и с большим содержанием жира. У этих ягнят был изменен иммунный ответ, имелась инсулин-резистентность и артериальная гипертензия [20]. Эти же авторы отметили у новорожденных овец изменение процессов метилирования в клетках печени [20]. В большинстве описанных экспериментов модификация диеты проводилась за несколько недель до зачатия. Однако оказалось, что преконцепционное влияние питания может оказать воздействие на плод и новорожденного даже при таких коротких экспозициях, как 4 дня до зачатия [26].
Стремительное развитие ВРТ привело к тому, что все большее количество будущих матерей подвергается значительному преконцепционному воздействию. Одним из таких является процедура индукции суперовуляции, являющаяся рутинным этапом процесса экстракорпорального оплодотворения. Для этого используются большие дозы гормонов, вызывающие одновременное созревание и овуляцию нескольких ооцитов. В экспериментах на мышах суперовуляция существенно влияла на процессы метилирования ДНК эмбриона и плода [26, 27]. Кроме того, этот эффект передавался через поколение и проявлялся в изменении процессов метилирования в сперматозоидах потомства [28]. Относительно сперматогенеза было также показано значительное влияние факторов внешней среды и преконцепционных условий на качество спермы и процессы метилирования при созревании сперматозоидов [29]. В экспериментах на крысах было продемонстрировано, что дефицит витамина В12 в рационе беременных приводил к рождению самцов с дефектом сперматогенеза и морфологическими изменениями яичек [30]. Кормление таких самцов после рождения пищей с нормальным содержанием витамина В12 способствовало частичному восстановлению структуры яичек и качества сперматогенеза [31].
Особенности преимплантационного развития эмбриона
Относительно короткое время от оплодотворения до имплантации содержит ряд важных событий. Они представлены первым делением (расщеплением), момент наступления которого является определенным индикатором правильного хода процесса развития, и активацией эмбрионального генома [24]. В это время (в стадию морулы) клеточная масса эмбриона становится более компактной и происходит формирование бластоцисты. Эмбрион при этом состоит из двух клеточных популяций: наружной поляризованной трофоэктодермы и внутреннего слоя, состоящего из плюрипотентных не поляризованных клеток. Из этих двух линий развиваются собственно плацента и плодовые клетки [24]. Процессы метилирования ДНК протекают по-разному в этих двух клеточных популяциях. Это становится важным поворотным пунктом в развитии эмбриона, и принадлежность этих клеток к двум линиям может быть предсказана по асимметрии модификации гистонов хроматина бластомеров в стадию расщепления [32].
Манипуляции с уровнем метилирования ДНК стволовых клеток мыши, полученных из линии бластоцисты плодовых клеток, имеют далеко идущие последствия для дифференциации стволовых клеток [33]. В этой связи становление и организация определенной картины процесса метилирования на этапе раннего эмбрионального развития чрезвычайно важны. В ходе преимплантационного развития изменение метаболических условий, чувствительности к стимулирующим воздействиям заменимых и незаменимых аминокислот, влияние ростовых факторов и изменения плотности рецепторов к ним происходит в строгой пространственно-временной последовательности [34]. Материнский организм обеспечивает создание определенной среды в полости маточных труб, которая соответствует требованиям этой последовательности. Собственно на этом этапе начинается процесс плодово-материнского взаимодействия, представляющего собой своеобразный диалог, где в роли сообщений выступают продукты метаболизма, ростовые факторы и ряд других биологически активных веществ.
Влияние манипуляций с внутренней средой труб и матки
Манипуляции с культурой клеток и целыми эмбрионами in vitro широко распространены для лечения бесплодия у человека, сохранения и спасения исчезающих видов животных. Однако, несмотря на технические успехи в области этих подходов и разработке все более оптимальных сред для культивирования клеток, условия для эмбриона, достигаемые in vitro, все еще не полностью воспроизводят условия внутри материнского организма [35]. Эта оценка стала результатом измерения скорости деления клеток бластоцисты, определения массы клеток трофоэктодермы и будущего плода, экспрессии генов эмбриона и его последующей выживаемости [35]. При отсутствии в среде альбумина, добавление в нее гранулоцит-макрофагального колоний-стимулирующего фактора (GM-CSF) может увеличить количество клеток бластоцисты и дальнейший рост клеточной массы [36]. Добавление GM-CSF в культуральную среду было способно предотвратить негативные последствия культурирования для роста плаценты и плода после переноса его в матку [37]. Как оказалось, эффект этот реализовался через увеличение площади плаценты и способности ее переносить нутриенты к плоду [37]. Несомненно, что изменение метаболической и сигнальной активности в ответ на вариации условий внешней среды как in vitro, так и in vivo должны сопровождаться соответствующими изменениями экспрессии генов. Сравнение эмбрионов крупного рогатого скота, культивируемых in vitro, с эмбрионами соответствующего возраста, находящимися в условиях in vivo, показало, что сам факт нахождения в культуральной среде влияет на широкий спектр генов, вовлеченных в контроль таких процессов, как транскрипция и трансляция, клеточный метаболизм, транспорт нутриентов, апоптоз, формирование межклеточных контактов [38]. Примечательно, что эти изменения наблюдались в определенной временной последовательности [39]. Оказалось, что уровень выживания эмбрионов после переноса в матку, зависел от среды, в которой они культивировались и от количества манипуляций, проведенных с ними в условиях in vitro [39]. Таким образом, в настоящее время накопилось достаточно фактов, позволяющих утверждать, что манипуляции с эмбрионом и изменения состава культуральной среды имеют далеко идущие последствия, простирающиеся не только на предимплантационный период, но и на время развития плода в матке, здоровье после рождения и в последующей жизни [39]. На крупном рогатом скоте и овцах был обнаружен так называемый синдром «крупного потомства» [40]. Было показано, что культивирование эмбрионов в среде, напоминающей внутриматочную среду с высоким содержанием прогестерона и плазмы матери, приводило после переноса эмбриона в матку к рождению животных с большим, чем у интактных весом. У таких новорожденных менялось отношение размеров внутренних органов к размерам тела и наблюдался более высокий уровень перинатальной смертности [40]. На мышах было показано, что сам факт нахождения эмбриона в культуральной среде без каких-либо манипуляций, а затем перенос его в матку приводил к рождению потомства с артериальной гипертензией [41]. У таких мышат была изменена также траектория роста и набора веса по сравнению с контролем [41]. У них же отмечены существенные изменения ключевых гомеостатических ферментов, участвующих в регуляции работы сердечно-сосудистой системы (ангиотензин-превращающего фермента) и метаболизма (печеночная фосфоэнол пируват карбоксилаза) [41]. Относительно недавно было показано, что эффекты культивирования эмбрионов могут распространяться даже на следующие поколения. При этом на мышах второго поколения наблюдалось изменение соотношения внутренних органов [42]. Есть предположение, что механизм этой «памяти» имеет эпигенетическую природу [42].
В экономически развитых странах мира 1–3% родов происходит после применения ВРТ [43], что сопровождается увеличением количества исследований, посвященных здоровью детей, рожденных в результате ВРТ. Одним из первых феноменов, с которым столкнулись исследователи, было увеличение процента преждевременных родов и низкий вес детей при рождении [44]. Зачастую это связывали с увеличением количества многоплодных беременностей, являющихся результатом переноса нескольких эмбрионов при искусственном оплодотворении [45]. Однако при более детальном изучении оказалось, что дети из одноплодных беременностей также имели более высокий риск преждевременного рождения и низкий вес [46]. У некоторых детей были обнаружены незначительные, но специфические изменения центральной нервной системы [47]. Ряд исследователей обнаружили связь между фактом искусственного оплодотворения и вероятностью развития детского церебрального паралича [47]. Дополнительно у детей от ВРТ в препубертатном периоде были обнаружены подъем систолического и диастолического давлений, увеличение концентрации глюкозы в крови, не зависящие от факторов ранней жизни и состояния здоровья родителей [47].
Было показано, что у детей от ВРТ имело место увеличение частоты некоторых синдромов, связанных с нарушением генного импринтинга. К таким видам патологии относились: синдром Беквит–Вайдемана, Ангельмана и синдром Силвер–Руссел [46].
Все эти синдромы связаны с нарушением метилирования генов.
Заключение
Представленные в литературе данные свидетельствуют о том, что такие факторы, как питание матери, дисбаланс гормонов, культивирование эмбрионов in vitro и другие эффекты окружающей среды могут вызвать значительные последствия и влиять на качество гамет и развитие эмбриона при использовании методик ВРТ. Все это является очевидным и практическим отражением справедливости теории «внутриутробного» или, как правильнее назвать, «перинатального» программирования заболеваний и состояния здоровья.
Следует подчеркнуть, что программирование заболеваний в перинатальный период не является необратимым процессом. В настоящее время доказано существование так называемого «тысячедневного окна» возможностей репрограммирования [47]. Под этим термином понимают период внутриутробного развития и два первых года жизни ребенка. В течение этого времени можно путем лечебных и профилактических мероприятий воздействовать на процессы экспрессии генов и вернуть траекторию развития организма в нормальное русло. Однако это возможно только при условии понимания патогенеза процесса программирования. В этом смысле, значительную помощь при разработке профилактических и лечебных мероприятий может оказать знание так называемых маркеров внутриутробного программирования. Анализ литературы и наши собственные исследования позволили составить список известных на сегодняшний день маркеров [48–50]. К их числу относятся: изменение соотношения размеров внутренних органов к размерам тела (печень, почки), изменение специфических мест отложения жира, динамика биометрических показателей в первые пять лет жизни, изменение соотношения липопротеинов низкой и высокой плотности, аминокислотного спектра плазмы крови, наличие инсулин-резистентности, изменение вариабельности сердечного ритма и артериального давления в ответ на проведение ортостатических проб, повышение концентрации мочевой кислоты в плазме крови, эхокардиографические маркеры соединительнотканной дисплазии (пролапсы клапанов, дополнительные хорды), изменение активности ренин-ангиотензиновой системы. Дальнейшие исследования проблемы перинатального программирования могут не только расширить список таких маркеров, но и разработать конкретные лечебно-профилактические мероприятия по улучшению здоровья будущего поколения.
