Проблема подготовки организма к родам, в частности своевременное созревание шейки матки в конце беременности, остается чрезвычайно актуальной в современном практическом акушерстве [1]. Доказано, что родовозбуждение при незрелой шейке матки связано с повышенной частотой различных осложнений со стороны как матери, так и плода (аномалии родовой деятельности, затяжные роды, внутриутробное страдание плода и т.д.) [3].
Известно, что созревание шейки матки является результатом сложного комплекса изменений в организме беременной, затрагивающих нейрогуморальную, эндокринную и иммунную системы [2]. Непосредственно перед родами резко усиливается миграция гранулоцитарных клеток в ткань шейки матки, что приводит к усилению деградации соединительнотканного компонента шейки матки, в частности коллагена, за счет продукции тканевыми гранулоцитами протеолитических ферментов, таких как матриксные металлопротеиназы (ММР) [4, 9]. В тканях шейки матки при ее созревании отмечено усиление продукции ММР-2, ММР-8 и ММР-9 [11]. Однако на системном уровне характер продукции этих протеолитических ферментов нейтрофилами беременных женщин на разных этапах созревания шейки матки остается практически не изученным. Известно, что основными регуляторами активности ММР являются цитокины, в число которых входят интерлейкины (IL-1, IL-8) и трансформирующий фактор роста β (TGF-β) [10]. В связи с этим уточнение взаимосвязи системной продукции цитокинов с особенностями протеолитической активности нейтрофилов периферической крови на разных этапах созревания шейки матки поможет углубить наши представления о механизмах, определяющих своевременную подготовку организма к родам.
Цель данного исследования – установить взаимосвязь характера экспрессии периферическими нейтрофилами мРНК ММР-9 и тканевого ингибитора ММР-9 (TIMP-1) с сывороточным содержанием TGF-β2 у первобеременных женщин при сроке гестации 38–40 нед для уточнения системных механизмов регуляции протеолитической активности нейтрофилов в процессе созревания
шейки матки.
Материал и методы исследования
В условиях акушерской клиники Ивановского НИИ материнства и детства было обследовано 106 первобеременных при сроке 38–40 нед. На момент обследования у всех женщин отсутствовали тяжелые формы гестоза, экстрагенитальной патологии, острые или обострение хронических воспалительных процессов. В зависимости от степени зрелости шейки матки по шкале E.H.Bishop обследованные женщины были разделены на 3 группы: 1-я группа – 41 женщина с незрелой шейкой матки, 2-я группа ‒ 35 женщин с недостаточно зрелой шейкой матки и 3 группа - 30 женщин со зрелой шейкой матки. Проведено полное клинико-лабораторное обследование всех беременных, применялся комплекс функциональных методов, включающий ультразвуковое исследование и кардиотокографию. Состояние шейки матки на фоне традиционной медикаментозной подготовки к родам в 1-й и 2-й группах оценивалось 1 раз в нед при влагалищном исследовании. Для уточнения особенностей исследуемых иммунологических показателей в конце гестационного периода до начала физиологических процессов ремоделирования тканей шейки матки дополнительно было обследовано 16 первобеременных женщин в 36 нед беременности, не отличавшихся по анамнезу и соматическому состоянию от женщин основных клинических групп наблюдения и не имевших признаков угрожающих преждевременных родов.
Материалом для иммунологического исследования служила периферическая венозная кровь из кубитальной вены. Иммунологическое исследование проводили однократно при поступлении женщины в стационар.
Для определения экспрессии мРНК MMP-9 и TIMP-1 нейтрофилами периферической крови использовали количественный метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Использованные в работе праймеры и зонды были синтезированы в лаборатории генной инженерии Гематологического научного центра РАМН (Москва) с использованием программного обеспечения Vector NTI Advance 10 (Invitrogen, США). Реакцию амплификации и обработку данных проводили на приборе iCycler iQ (BioRad, USA). Полученные результаты представлены как нормализованное относительно уровня экспрессии мРНК гена домашнего хозяйства (β2-микроглобулина) количество копий специфического гена в образце, умноженное на 104 /мкл.
Сывороточную концентрацию TGF-β2 определяли методом твердофазного иммуноферментного
анализа на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Финляндия) с помощью коммерческой тест-системы (Bender MedSystems, Австрия). Анализ проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Предел чувствительности тест-системы составил 10 пг/мл.
Статистическую обработку данных выполняли на персональном компьютере с определением среднего арифметического показателя и его ошибки. Достоверность различий рассчитывали по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
Возраст беременных колебался от 17 до 32 лет. Обследованные всех трех групп практически не отличались по среднему возрасту, характеру менструальной функции и началу половой жизни. Была выявлена высокая частота гинекологических заболеваний в анамнезе у обследованных первобеременных женщин. В структуре гинекологической патологии наиболее часто встречались воспалительные процессы гениталий (61; 73,3 и 51,43% соответственно в 1, 2 и 3-й группах), эктопия шейки матки (36,6; 54,3 и 50% соответственно). При этом все три группы были сопоставимы по данным показателям. В 1-й группе по сравнению с 3-й было больше женщин, страдавших нейроциркуляторной дистонией по смешанному типу (9,8%, p<0,05), патологией щитовидной железы (17,1%, p<0,05) и анемией беременных (48,8%, p<0,01). Ранний гестоз в 1-й группе отмечался достоверно чаще (24,4%),
чем в 3-й (6,7%, p<0,05). Остальные осложнения данной беременности, такие как угроза прерывания, инфекционные заболевания, гестоз II и III триместров, у обследованных всех групп имели одинаковую частоту.
Анализ уровня экспрессии гена ММР-9 периферическими нейтрофилами показал, что в процессе созревания шейки матки происходит постепенное повышение данного показателя. Так, у женщин в 36 нед гестации уровень экспрессии мРНК ММР-9 периферическими нейтрофилами был минимальным, ниже предела детектируемых значений (N/A). В группах беременных с незрелой и недостаточно зрелой шейкой матки уровень экспрессии мРНК ММР-9 периферическими нейтрофилами постепенно повышался по мере созревания шейки матки, однако данный показатель был достоверно снижен относительно аналогичного параметра у женщин со зрелой шейкой матки (p<0,001, p<0,05 соответственно). Максимальные значения уровня экспрессии мРНК MMP-9 мы отмечали в группе
женщин с полностью готовыми родовыми путями (см. таблицу).
Таблица. Характеристика экспрессии мРНК ММР-9 и TIMP-1 нейторофилами в переферической крови беременных женщин с разной степенью готовности организма к родам.
Для уточнения механизмов, определяющих изменение синтеза протеолитических ферментов нейтрофилами крови на разных этапах подготовки организма к родам, мы оценили динамику экспрессии периферическими нейтрофилами мРНК тканевого ингибитора MMP-9 – TIMP-1. Анализ данных показал, что уровень экспрессии мРНК TIMP-1 у женщин в 36 нед гестации в отсутствие признаков начала подготовки организма к родам был достаточно высоким, затем экспрессия мРНК TIMP-1 начинала снижаться на начальных этапах созревания шейки матки, достигая минимальных значений в группе женщин с недостаточно зрелой шейкой матки. Однако к моменту родоразрешения вновь отмечалось повышение уровня экспрессии мРНК TIMP-1 нейтрофилами периферической крови
(см. таблицу).
Для оценки баланса протеолитической и антипротеолитической активности периферических нейтрофилов у женщин с разной степенью подготовленности к родам мы определяли индекс соотношения активности ММР-9/TIMP-1. Было установлено, что на начальных этапах процесса подготовки организма к родам доминировала антипротеолитическая активность нейтрофилов, индекс активности ММР-9/TIMP-1 составил 0,62±0,28. Однако в процессе созревания шейки матки протеолитическая активность нейтрофилов начинала преобладать над антипротеолитической активностью, индекс соотношения ММР-9/TIMP-1 в группах женщин с недостаточно зрелой и зрелой шейкой матки составил 1,52±0,65 и 3,63±1,44 соответственно.
Учитывая важную роль цитокинов в регуляции активности ММР, для определения возможных факторов, регулирующих синтез протеолитических ферментов циркулирующим пулом нейтрофилов в конце гестационного процесса, мы изучили сывороточное содержание TGF-β2 у женщин с различной степенью зрелости шейки матки. Было установлено, что в группе женщин в 36 нед беременности сывороточный уровень TGF-β2 был максимальным и составил 1630,09±605,20 пг/мл. В процессе созрева-
ния шейки матки концентрация TGF-β2 в сыворотке крови начинала прогрессивно снижаться и составила 1259,26±297,13 пг/мл у женщин с незрелой шейкой матки и 835,63±303,46 пг/мл у женщин с недостаточно зрелой шейкой матки. В группе пациенток с абсолютно готовыми родовыми путями этот показатель имел минимальные значения – 430,76 ±255,07 пг/мл.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при подготовке организма к родам происходит усиление протеолитической активности нейтрофилов не только непосредственно в самой ткани шейки матки, но и на системном уровне. Наши исследования показали, что усиление экспрессии нейтрофилами периферической крови мРНК ММР-9 в процессе созревания шейки матки ассоциировано с постепенным снижением активности специфического ингибитора ММР-9 – TIMP-1 и уменьшением сывороточного уровня TGF-β2.
Известно, что MMP-9, или желатиназа, отностится к цинкзависимым эндопептидазам и гидролизует коллаген и эластин базальных мембран [5, 8]. Ранее было показано, что ММР-9 непосредственно участвует в ремоделировании тканей шейки матки в процессе подготовки организма к родам [11]. Нами было выявлено усиление экспрессии мРНК ММР-9 на фоне угнетения синтеза TIMP-1 нейтрофилами периферической крови в процессе созревания шейки матки. Полученные данные позволяют говорить о том, что активность процессов деградации коллагена и других структурных компонентов внеклеточного матрикса в тканях шейки матки, которые определяют ее зрелость, по-видимому, изначально определяется изменением протеолитической активности циркулирующего в периферической крови пула нейтрофилов.
Можно предположить, что локальные процессы созревания шейки матки непосредственно находятся под контролем системных иммунных механизмов. К этим механизмам, по-видимому, относится изменение сывороточного содержания TGF-β2 в конце гестационного процесса. Принято считать, что данный цитокин является иммуносупрессорным фактором, который необходим для формирования толерантности к плоду на протяжении всей беременности [6]. Показано, что TGF-β снижает продукцию ММР, в частности ММР-9, и индуцирует активность TIMP-1 [4]. Существует мнение о том, что в конце гестации значимость процессов иммуносупрессии снижается [7]. Полученные нами результаты, свидетельствующие о прогрессивном снижении сывороточного содержания TGF-β2 в периферической крови по мере подготовки организма к родам, также подтверждают это предположение. По-видимому, снижение активности процессов иммуносупрессии в конце гестации ведет к повышению уровня протеолитической активности периферических нейтрофилов, что в итоге
определяет усиление деструктивных изменений коллагенового остова шейки матки при ее ремоделировании перед родами за счет высокой выработки ММР тканевым пулом нейтрофилов.
Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что в число
механизмов, приводящих к ремоделированию тканей шейки матки перед родами, относится усиление протеолитической активности периферических нейтрофилов, проявляющееся увеличением экспрессии данным пулом клеток мРНК ММР-9 на фоне снижения экспрессии мРНК TIMP-1. Прогрессивное снижение сывороточного содержания TGF-β2 в процессе подготовки организма к родам, по-видимому, является
одним из факторов, регулирующих продукцию протеолитических ферментов периферическими фагоцитами в конце гестационного процесса.
