Доказано, что возраст женщины прямо коррелирует с вероятностью рождения ею ребенка с такими грубыми хромосомными нарушениями, как трисомия по 21-й, 13-й и 18-й хромосомам, которые приводят в свою очередь к развитию синдрома Дауна, Патау и Эдвардса соответственно. Такие нарушения числа хромосом, приводящие к дисбалансу генома, называют анеуплоидиями. Также возраст женщины прямо коррелирует с вероятностью выкидыша или развития у нее невынашивания беременности. Показано, что данные патологические состояния также ассоциированы с грубыми хромосомными патологиями, причем спектр вовлекаемых в них хромосом не исчерпывается только 13-й, 18-й и 21-й хромосомами, а затрагивает весь геном полностью.
Широкое внедрение в жизнь вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) сделало возможным для миллионов семей во всем мире повлиять на эту ситуацию. К тому же не секрет, что к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) все чаще прибегают женщины старшего репродуктивного возраста (более 35 лет).
Еще в 1993 г. Munne была выдвинута идея, что выявление и элиминация эмбрионов с хромосомными нарушениями из программы ЭКО может увеличить шансы пациентки на успешную беременность. Такой подход получил название преимплантационного генетического скрининга (ПГС). Следует отличать ПГС от преимплантационной генетической диагностики (ПГД), которая призвана выявлять «точечные», конкретные заболевания у эмбрионов, носителями которых являются один или оба супруга. Задачей ПГД является рождение ребенка, который не несет мутантного гена, приводящего к развитию того или иного заболевания. Задачей ПГС является увеличение частоты наступления клинической беременности и снижение к минимуму вероятности рождения ребенка с грубыми хромосомными патологиями.
Полученные в ходе проведения первых опытов данные по применению ПГС в клинической практике оказались противоречивыми. Это связано с тем, что в качестве метода, обеспечивавшего проведение ПГС, исследователи использовали fluorescent in situ hybridization (FISH). Данная методика, заключающаяся в специфическом окрашивании ДНК-зондами иммобилизованных на стекле клеток (полярных телец, бластомеров и трофоэктодермы), хорошо зарекомендовала себя для проведения пренатальной диагностики (ПД), но оказалась неподходящей для ПГС. Дело в том, что ее ограничением является количество хромосом, подвергающихся анализу. В большинстве случаев изучали 5–7, реже 9–12 хромосом. Однако, как было сказано выше, анеуплоидии способны затрагивать все хромосомы в геноме эмбриона, что снижало чувствительность использования FISH в ПГС. Другим немаловажным фактором, который повлиял на низкую эффективность применения FISH в ПГС, является субъективность метода, в значительной мере зависящего от врача, проводящего диагностику.
Указанных выше недостатков лишен метод сравнительной геномной гибридизации на чипах или хромосомный микроматричный анализ (ХМА, array comparative genome hybridization, aCGH). Данный метод появился как развитие метода сравнительной геномной гибридизации, разработанного Kallioniemi с соавторами в 1992 г.
Для проведения хромосомного микроматричного анализа выделенная из исследуемого материала ДНК подвергается фрагментации и последующему мечению флуоресцентным красителем (например, Cy5). Такой же обработке в другой пробирке подвергается эквимолярное количество референсной ДНК, с которой впоследствии будет сравниваться исследуемая ДНК, только ее мечение происходит с участием другого флуорофора (например, Cy3). После этого данные образцы смешиваются и наносятся на биологический чип. Он представляет собой стеклянную пластинку с нанесенными на нее олигонуклеотидными зондами. Структура и число ДНК-зондов выбирается таким образом, чтобы наиболее полно был представлен геном исследуемого организма, то есть каждый зонд является комплиментарным участком того или иного региона ДНК. Регионы, представляющие наибольший интерес (кодирующие и регуляторные области, участки генома, копийность которых доказано ведет к развитию тех или иных заболеваний), как правило, представлены на биочипе с большей плотностью, чем в остальных регионах. Общее число зондов, нанесенных на чип, может достигать миллиона, но, как правило, измеряется десятками и сотнями тысяч.
При нанесении смеси меченых фрагментов ДНК на биочип происходит их конкурентное связывание с комплиментарными зондами. При наличии в анализируемом геноме делеций с соответствующими им зондами будут преимущественно связываться фрагменты референсной ДНК, и наоборот, при наличии в анализируемом геноме дупликаций – фрагменты опытной ДНК. После инкубации и отмывки биочипа от несвязавшейся с зондами ДНК происходит измерение флуоресценции конъюгированных с зондами меченых фрагментов. По характеру этой флуоресценции (интенсивности и паттерну сигналов разных флуорофоров) можно сделать вывод о различиях между исследуемой и референсной ДНК.
Результат исследования, очевидно, зависит от используемого для данного эксперимента чипа. Важно помнить, что выявленные в эксперименте делеции и дупликации зависят как от представленности в данном регионе олигонуклеотидных зондов (то есть от дизайна биочипа), так и от алгоритма обсчета полученных результатов.
Применение хромосомного микроматричного анализа для проведения ПГС накладывает на методику еще одно ограничение. Как уже говорилось ранее, для анализа используется всего одна клетка. Количество ДНК в одной клетке слишком мало, чтобы быть нанесенным непосредственно на биочип, следовательно, его нужно увеличить тем или иным способом. Как правило, для этого используются такие методики, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и multiple displacement amplification (MDA). Добавление в протокол ХМА такого шага, как амплификация единичных копий ДНК, приводит к снижению разрешающей способности метода. Это связано с тем, что при прохождении амплификации невозможно гарантировать одинаковый уровень представленности всего генома после окончания реакции. Амплификация разных участков ДНК будет проходить с разной эффективностью, причем некоторые участки ДНК вообще не амплифицируются. Этот эффект получил название drop-out, и его выраженность зависит как от метода (ПЦР или MDA), так и от производителя соответствующих наборов. С другой стороны, как уже было отмечено выше, ПГС – это скрининг хромосомной сбалансированности генома, то есть drop-out отдельных областей хромосом не оказывает существенного влияния на результаты диагностики в целом.
Впервые сравнительная геномная гибридизация на чипах для ПГС была проведена в 2008 году Ali Hellani, и в настоящее время список клиник, применяющих его в своей практике, постоянно расширяется. Но хотя эффективность использования ХМА для ПГС в целом подтверждена большим количеством публикаций, на сегодня остается еще много вопросов, вызывающих дискуссии.
Наибольшее количество вопросов вызывает объект исследования, то есть тот биологический материал, который эффективнее всего использовать для проведения ПГС. Действительно, объектом исследования могут служить полярные тельца (I и II), единичные бластомеры (эмбрион 3-го дня развития), трофоэктодерма (эмбрион 5-го дня развития). Продолжением данной дискуссии становится вопрос, стоит ли проводить ПГС в свежем или криоцикле. В настоящее время исследование полярных телец, как правило, обусловлено законодательными ограничениями в тех или иных странах, не позволяющими проводить диагностику непосредственно эмбрионов. Однако использование полярных телец для диагностики не позволяет выявлять анеуплоидии, возникающие после оплодотворения яйцеклетки сперматозоидом, что значительно снижает эффективность ПГС. Использование трофоэктодермы для диагностики, с одной стороны, оправдано тем, что перед проведением ПГС происходит естественная селекция эмбрионов, так как до пятого дня развития доживают не все эмбрионы, а только обладающие повышенным репродуктивным потенциалом. С другой стороны, методика биопсии трофоэктодермы по сравнению с биопсией бластомеров значительно более трудоемкая, требует большого опыта и может выполняться далеко не всеми эмбриологами, что также может негативно влиять на результаты ПГС (отсутствие результатов диагностики в связи с утерей биологического материала в процессе биопсии трофоэктодермы).
Нельзя забывать, что эффективность ПГС зависит от многих факторов, таких как возраст пациентки, ее анамнез, квалификация и технические возможности эмбриолога, выбор объекта диагностики и так далее. Несмотря на такое количество факторов, на сегодняшний день уже ни у кого не вызывает сомнений тот факт, что применение сравнительной геномной гибридизации на биочипах для проведения преимплантационного генетического скрининга достоверно повышает вероятность появления на свет желанного здорового малыша.
По результатам внедрения преимплантационного скрининга на основе сравнительной геномной гибридизации на биочипах в клиническую практику ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова было показано, что применение данной методики в группе пациенток в возрасте до 30 лет повышало частоту наступления клинической беременности на перенос с 35 до 50%, в группе пациенток в возрасте от 30 до 40 лет – с 31 до 42% и в группе пациенток старше 40 лет – с 14 до 33%.
NGS
Относительно недавно для проведения ПГС стали применять технологии высокопроизводительного секвенирования, сокращенно NGS (next generation sequencing). Первая стадия анализа, как и в случае применения биочипов, заключается в полногеномной амплификации исследуемого биологического материала (бластомеры, трофоэктодерма, полярные тельца). Полученные продукты амплификации собираются в так называемые библиотеки и подвергаются в дальнейшем непосредственно секвенированию. Принцип метода NGS заключается в определении нуклеотидных последовательностей, образуемых в ходе полногеномной амплификации, причем кроме этого в ходе анализа получается информация о том, сколько было осуществлено прочтений («ридов») данной нуклеотидной последовательности. Очевидно, что если в исследуемом образце присутствует трисомия по одной из хромосом, то и прочтений этой хромосомы будет, соответственно, больше, чем остальных. Такая же ситуация, только с обратным знаком, наблюдается при моносомиях.
Основным преимуществом NGS по сравнению с чиповыми технологиями является возможность определения нуклеотидной последовательности в исследуемом регионе. Однако представленность генома в подвергаемых секвенированию библиотеках зависит не только и не столько от методики секвенирования, сколько от методики полногеномной амплификации, предшествующей анализу.
Недостатком методики одно время являлась высокая стоимость высокопроизводительного секвенирования, даже по сравнению с достаточно дорогими чиповыми технологиями. Вместе с тем благодаря тому, что каждый год наблюдается снижение стоимости высокопроизводительного секвенирования, в настоящее время это привело к тому, что происходит переход в ПГС от чиповых технологий к высокопроизводительному секвенированию, в том числе и в нашей лаборатории начиная с этого года для проведения ПГС мы практикуем данную технологию.
Одним из наиболее перспективных направлений использования технологии высокопроизводительного секвенирования в клинической практике является неинвазивный ДНК-скрининг анеуплоидий у плода по крови матери.
Доказано, что во время беременности в крови матери циркулируют как фетальные клетки, так и свободная фетальная ДНК. Уровень фетальной ДНК может достигать 15% всей свободной ДНК в крови матери. Высокопроизводительное секвенирование выделенной свободной ДНК позволяет довольно точно выявить риск наличия анеуплоидий у плода. Сегодняшний уровень чувствительности и специфичности подобной методики таков, что многие авторы предлагают отказаться от проведения биохимического скрининга беременности в пользу проведения неинвазивного пренатального ДНК-скрининга хромосомных патологий с помощью высокопроизводительного секвенирования. Вместе с тем надо отметить, что как чувствительность, так и специфичность данной методики все-таки ниже классического кариотипирования, поэтому положительные результаты ДНК-скрининга следует проверять уже с помощью инвазивной пренатальной диагностики с применением амниоцентеза или биопсии хориона. К тому же необходимо учитывать высокую стоимость данного подхода в настоящее время. В будущем уменьшение стоимости неинвазивного пренатального ДНК-скрининга анеуплоидий по крови матери действительно приведет к тому, что он заменит собой проведение биохимического скрининга. И хотя данный метод не позволяет полностью избавиться от инвазивных процедур, он позволяет существенно сократить их количество и тем самым во многих случаях избежать риска травмирования плода из-за проведения инвазивного забора материала.
В нашей лаборатории также внедрена данная технология и успешно используется в практике.
