По данным статистики, примерно 15% супружеских пар в популяции бесплодны, причем на
долю мужского фактора бесплодия приходится 50% случаев [11].
Главными генетическими причинами мужского бесплодия, сопряженного с тяжелыми
формами патозооспермии, являются делеции AZF-локуса хромосомы Y (фактор азооспермии) и мутации гена трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR – cystic fibrosis transmembrane conductase regulator) [1, 3, 7]. По различным данным общая распространенность мутации AZF-локуса хромосомы Y среди мужчин с выраженными отклонениями в показателях спермограммы составляет 3,2–12,2%, при этом микроделеции значительно чаще выявляются при необструктивной азооспермии [1, 2, 5, 6, 7].
AZF-локус расположен в длинном плече хромосомы Y – Yq11 и разделен на 4 неперекрывающиеся области – AZFa, AZFb, AZFc и AZFd субрегионы [11]. Наиболее часто микроделеции определяются в AZFc субрегионе, их доля составляет 65–70% от всех полных AZF делеций [2, 5, 6, 7]. Среди мужчин с обструктивной азооспермией вследствие врожденного одностороннего или двустороннего отсутствия семявыносящих протоков и при секреторной азооспермии мутации в гене CFTR встречаются значительно чаще, чем в общей популяции и могут достигать 70% [1, 13]. Самой распространенной мутацией в гене CFTR является F508del и полиморфизм – аллель 5Т [4, 7, 12].
R. Tomaiuolo и соав. выявили, что белок, экспрессируемый геном CFTR, принимает участие
как в процессе сперматогенеза, так и в функционировании маточных труб. Было сделано предположение, что полиморфизм этого же гена может приводить к развитию выраженной олигозооспермии у мужчин и трубному бесплодию у женщин [13].
В настоящее время благодаря разработке и широкому внедрению в клиническую практику таких микроманипуляционных методик, как TESA и ИКСИ, мужчины с тяжелой патозооспермией, ранее обреченные на бесплодие, могут иметь потомство. Однако мутации, имеющиеся в генотипе родителей, могут передаваться будущему потомству через гаметы при проведении программы ЭКО/ИКСИ, в результате чего могут образоваться генетически неполноценные эмбрионы [6].
Данные многочисленных исследований указывают на возможность передачи мутации AZF-локуса хромосомы Y от отца сыну, что впоследствии может привести к бесплодию у потомства. В литературе описаны случаи возникновения de novo микроделеции хромосомы Y у потомства
мужского пола, полученного в программе ЭКО/ИКСИ [6, 8]. Некоторые авторы связывают возникновение у потомства de novo делеций AZF-локуса хромосомы Y с мозаицизмом этой мутации
в сперматозоидах у отцов. Возможность передачи поврежденной хромосомы Y сыновьям зависит от
соотношения уровней сперматозоидов с мутацией и без [8].
Ряд исследователей при проведении FISH-анализа ядер сперматозоидов мужчин с микроделецией AZFc (b2/b4) выявили увеличение уровня сперматозоидов с нуллисомией и дисомией-XY. С этой точки зрения авторы рассматривают микроделецию хромосомы Y как премутацию с возможностью последующей полной потери хромосомы Y. У таких мужчин повышен риск рождения ребенка с кариотипом 45,Х0 (синдром Шерешевского-Тернера) [10].
Это было подтверждено немногочисленными данными проведенной преимплантационной диагностики (ПД) эмбрионов у пациентов с делециями AZF-локуса хромосомы Y, которые выявили высокую частоту хромосомной патологии в эмбрионах по гоносомам [9].
На сегодняшний день медико-генетическое консультирование с проведением ПД эмбрионов в рамках программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволяет супружеским парам с генными нарушениями проводить профилактику наследования мутаций потомством. Кроме того,
при наличии делеций AZF-локуса хромосомы Y у мужчин при проведении ПД эмбрионов в рамках программы ЭКО/ИКСИ отбираются эмбрионы женского пола без хромосомной патологии для переноса их в полость матки супруги, что предупреждает рождение генетически больного ребенка,
снижает риск выкидышей и тем самым повышает эффективность программы ЭКО/ИКСИ [10].
Целью настоящего исследования явилось выявление распространенности и характера генных
нарушений у пациентов с патозооспермией, а также изучение уровня и характера хромосомных
нарушений в эмбрионах пациентов с одновременным наличием мутации AZF-локуса хромосомы Y и полиморфизма гена CFTR.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 380 супружеских пар с мужским фактором бесплодия, которые
нуждались в проведении программы ЭКО/ИКСИ. Для выявления генетических изменений у пациентов применяли молекулярно-генетический метод. Спермиологический анализ эякулята проводили в
соответствии с рекомендациями ВОЗ от 2010 г.
ПД с выбором пола эмбрионов и скринингом на анеуплоидии хромосом Х, Y, 13, 18, 21 была
проведена у двух супружеских пар с первичным бесплодием, где у мужей отмечалась азооспермия
и астенотератозооспермия и были выявлены мутации в локусе AZFc хромосомы Y и аллель 5Т. У жен
исследование гена CFTR не выявило генетических отклонений. Возраст женщин был 28 и 25 лет.
Возраст обоих мужчин был 28 лет. У данных супружеских пар был определен нормальный кариотип. Для FISH-исследования ядер бластомеров эмбрионов использовали зонды фирмы Abbott на хромосомы Х, Y, 13, 18, 21.
Результаты исследования и обсуждение
Было исследовано 380 образцов ДНК мужчин с азооспермией и другими отклонениями в показателях спермограммы на наличие мутаций в гене CFTR и микроделеций в AZF-локусе хромосомы Y. Мутации и полиморфизм гена CFTR были обнаружены у 48 мужчин, что составило 12,6%, из них аллель 5Т выявлялся в 79% случаев. При выявлении у супруга мутаций в гене CFTR жене также было рекомендовано проведение аналогичного исследования. В двух наблюдениях оба супруга являлись носителями мутаций. У первой супружеской пары, где у мужа была выявлена мутация F508del и аллель 5Т, у жены также был выявлен аллель 5Т; у другой пары у мужа был определен аллель 5Т, а у жены мутация гена СFTR – F508del.
Наличие микроделеций в AZF-локусе хромосомы Y было выявлено в 14,2% случаев. Самой распространенной мутацией AZF-локуса хромосомы Y была микроделеция субрегиона AZFc – del sY 1192, она составила 59,6% случаев.
Супружеским парам с делецией AZF-локуса хромосомы Y у мужа с целью профилактики передачи данной мутации потомству мужского пола было рекомендовано проведение программы ЭКО/ИКСИ с ПД эмбрионов и селекцией эмбрионов женского пола для переноса в матку супруги.
Особый интерес представляют супружеские пары с сочетанными мутациями. Среди обследованных супружеских пар у 7 было выявлено одновременное наличие у мужей различных микроделеций субрегиона AZFc с гетерозиготным носительством полиморфизма гена CFTR – аллель 5Т, и в одном случае – с мутацией гена CFTR – G542Х.
У двух супружеских пар с одновременным наличием у мужей мутации в локусе AZFc хромосомы Y
и аллеля 5Т было проведено 4 цикла стимуляции суперовуляции. У первой пациентки 1 цикл, у второй – 3 цикла. Всего из 35 ооцитов было получено 20 эмбрионов (57,1%). Морфологическую оценку
качества полученных эмбрионов проводили на основании числа бластомеров на третьи сут эмбрионального развития, их симметрии и наличия экстрацеллюлярной фрагментации. Так, качество эмбрионов оценивалось как «хорошее» при наличии >6 бластомеров и <10% фрагментации. Из 20 полученных эмбрионов было 6 (30%) эмбрионов «хорошего» качества и 14 (70%) эмбрионов «плохого» качества. Однако по медицинским показаниям и настойчивому желанию пациентов биопсия бластомеров была выполнена у всех полученных эмбрионов на третьи сут эмбрионального развития.
Из 20 полученных бластомеров 2 не содержали ядер, в 2 бластомерах было по 2 ядра, в одном случае FISH-диагностика была проведена, но в 1 ядре сигналы отсутствовали; в другом случае исследование не проводилось. Таким образом, общее число проанализированных ядер составило 17.
При исследовании половых хромосом в 17 ядрах анеуплоидия была выявлена в 41,2%. В 3 ядрах
был выявлен нормальный женский хромосомный набор, в 7 ядрах был выявлен нормальный мужской хромосомный набор, в 2 ядрах – Х0 (синдром Шерешевского-Тернера), в 2 – ХХY (синдром
Клайнфелтера), в 1 – ХYY, в 1 – ХХХ, в 1 – Y0.
В 3 попытках у двух супружеских пар была проведена FISH-диагностика ядер бластомеров не
только по гоносомам, но и по аутосомам 13, 18 и 21. Исследование хромосомы 18 было произведено в 11 ядрах бластомеров. В 3 (27%) ядрах были выявлены анеуплоидии: в двух случаях – трисомия хромосомы 18, в одном – нуллисомия. Исследование хромосом 13 и 21 было проведено в 6 ядрах бластомеров. В 2 (33,3%) ядрах были выявлены сочетанные анеуплоидии по исследуемым хромосомам: в одном случае – моносомия хромосомы 13 и трисомия 21, в другом случае – моносомии хромосом 13 и 21.
В результате программы ЭКО/ИКСИ 2 пациенткам в 4 циклах было перенесено 2 эмбриона
женского пола. В 2 циклах перенос эмбрионов не производился по причине отсутствия эмбрионов женского пола без хромосомной патологии (см. таблицу).
Таблица. Данные ПД эмбрионов супружеских пар с одновременным наличием у мужей мутации
в локусе AZFc хромосомы Y и аллеля 5Т.
У женщины 28 лет наступила беременность после попытки ЭКО/ИКСИ+TESA+ПД, в результате которой родилась живая, здоровая девочка (в анамнезе – 2 неудачные попытки ЭКО/ИКСИ+TESA без ПД). Вторая супружеская пара после 3 неудачных попыток ЭКО/ИКСИ+ПД была включена в программу ЭКО с использованием спермы донора – беременность наступила с первой попытки.
Несмотря на то что представленные данные получены на малых выборках, мы считаем, что пациенты, имеющие одновременно несколько генетических особенностей, заслуживают пристального внимания. Учитывая стремительное развитие и внедрение новых технологий ВРТ, позволяющих иметь потомство супружеским парам с ранее неизлечимыми формами бесплодия, логично предположить, что в данной группе пациентов генетические нарушения, в том числе их сочетания, будут встречаться чаще.
Таким образом, с учетом большой распространенности генных нарушений у мужчин с патозооспермией, эти пациенты составляют группу риска по рождению больного ребенка. А у мужчин с патозооспермией, имеющих одновременно несколько генетических особенностей, этот риск увеличивается за счет возникновения мутаций de novo как по гоносомам, так и по аутосомам. В связи
с тем что в эмбрионах супружеских пар с одновременным наличием у мужей мутации в AZF-локусе
хромосомы Y и полиморфизма гена CFTR были выявлены анеуплоидии по аутосомам, можно сделать предположение, что число исследуемых аутосом в эмбрионах желательно увеличить. К сожалению, в настоящее время в нашей стране методы по выявлению генных мутаций в эмбрионах пока не внедрены в широкую клиническую практику. Для данной группы пациентов профилактические мероприятия по предупреждению рождения ребенка с генетической патологией должны быть
расширены и стать неотъемлемой частью программы ВРТ.
