Лаборатория редактирования генома

Зав. лабораторией: д.б.н., проф. РАН Ребриков Денис Владимирович

Сотрудники лаборатории: младший научный сотрудник Лоломадзе Е.А., студент Каменский А.Д., студент Давыгора К.С., студент Фиошкина Д.С.

Задачи:

• Разработка геноредактирующих препаратов для модификации генома человека на стадии зиготы.
• Разработка геноредактирующих препаратов для модификации генома человека на стадии зиготы, in vivo и in situ.
• Отработка протоколов проверки эффективности и безопасности геноредактирующих препаратов для модификации генома человека на стадии зиготы.
• Разработка технологий направленной модификации генома человека методом CRISPR-Cas9 на стадии зиготы.
• Исследование возможности доставки систем редактирования генома человека посредством вирусных систем;
• Иные генетические и молекулярно-биологические исследования, обеспечивающие привлечение финансирования и рост публикационной активности.
• Основные научные направления:
• Отработка протоколов проверки эффективности и безопасности геноредактирующих препаратов для модификации генома человека на стадии зиготы.
• Разработка технологий направленной модификации генома человека методом CRISPR-Cas9 на стадии зиготы.
• Исследование возможности доставки систем редактирования генома клеток человека посредством Torque teno virus.
• Исследование распространённости и вирусной нагрузки Torque teno virus для различных групп пациентов.
• Разработка тест-системы для ранней диагностики рака молочной железы и рака яичников на основе анализа свободно циркулирующих (внеклеточных) РНК периферической крови.
• Исследование ассоциации генетических полиморфизмов с различными заболеваниями.

Быстро развивающиеся технологии редактирования генома из научно-исследовательских лабораторий уверенно переходят в клиническую практику. Разработаны принципиально новые методы изменения генома человеческих эмбрионов на ранних стадиях развития. Создан инструментарий для исправления генетических нарушений у людей в любом возрасте. Врач, по сути, становится корректором генетической инструкции по построению и функционированию организма человека.

Развитие CRISPR-технологий в последние годы значительно расширило сферу их применения и способствовало продвижению методов редактирования генома в клиническую практику. Изменение гена CCR5 путем редактирования генома CD4+-T-клеток является одним из способов предотвращения распространения ВИЧ-1-инфекции. Однако похожая стратегия защиты от ВИЧ может быть использована и для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию. Создание «естественного» аллеля CCR5delta32 на стадии зиготы может защитить плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития и родов.

Три месяца назад китайский исследователь Хэ Цзянькуй заявил, что в рамках его эксперимента родились дети с внесенной при помощи технологии CRISPR на стадии зиготы модификацией генома CCR5delta32.

Наша лаборатория уже более двух лет проводит подобные модификации, однако мы не переносим полученные эмбрионы с целью деторождения, поскольку безопасность такого редактирования генома подтверждена пока недостаточно.

Для подтверждения эффективности и безопасности геномного редактирования на стадии зиготы мы создали уникальную систему проверки, когда геномы доноров гамет и модифицированных эмбрионов определяются полностью. В этом случае мы можем достоверно установить наличие или отсутствие нецелевой активности редактирующего фермента (так называемая off target активность).

В одном из уже опубликованных исследований мы оптимизировали систему CRISPR-Cas9 под создание гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному варианту CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов (более двух), непригодные для ЭКО. 16 аномальных зигот от доноров с WT CCR5 были инъецированы разработанной системой CRISPR-Cas9 в S-фазе. После инъекции зиготы помещали в культуральную среду Blastocyst (COOK) и культивировали в течение 5 дней в CO2-инкубаторе до стадии бластоцисты (приблизительно 250 клеток). Для анализа эффективности редактирования генома 8 успешно развивавшихся эмбрионов были генотипированы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (100% гомозиготы по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один – около 20% мозаицизма по WT CCR5. Таким образом, эффективность разработанной CRISPR-Cas9 системы для создания аллеля CCR5delta32 в эмбрионах человека довольно высока: более половины эмбрионов оказываются полностью модифицированными.

Основные публикации лаборатории за последние 2 года:

1. Tyschik E.A., Shcherbakova S.M., Ibragimov R.R., Rebrikov D.V. Transplacental transmission of torque teno virus. Virol J. 2017 May 8;14(1):92. doi: 10.1186/s12985-017-0762-0.
2. Тыщик Е.А., Кометова В.В., Родионов В.В., Ребриков Д.В. Оценка представленности внеклеточных РНК изоформ VEGF в плазме крови пациенток с раком молочной железы. Вестник РГМУ. 2017; (4): 26–30. DOI: 10.24075/brsmu.2017-04-04.
3. Komech E.A., Pogorelyy M.V., Egorov E.S., Britanova O.V., Rebrikov D.V., Bochkova A.G., Shmidt E.I., Shostak N.A., Shugay M., Lukyanov S., Mamedov I.Z., Lebedev Y.B., Chudakov D.M., Zvyagin I.V. CD8+ T cells with characteristic T cell receptor beta motif are detected in blood and expanded in synovial fluid of ankylosing spondylitis patients. Rheumatology (Oxford). 2018 Jun 1;57(6):1097-1104. doi: 10.1093/rheumatology/kex517.
4. Tyschik E.A., Rasskazova A.S., Degtyareva A.V., Rebrikov D.V., Sukhikh G.T. Torque teno virus dynamics during the first year of life. Virol J. 2018 May 30;15(1):96. doi: 10.1186/s12985-018-1007-6.
5. Смирнов Г.П., Малышев П.П., Рожкова Т.А., Зубарева М.Ю., Шувалова Ю.А., Ребриков Д.В., Титов В.Н. Влияние распространенного варианта RS2230806 гена АВСА1 на уровни липидов плазмы у пациентов с дислипидемией. КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2018; 63(7) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-7-410-413.
6. Смирнов Г.П., Рожкова Т.А., Зубарева М.Ю., Шувалова Ю.А., Ребриков Д.В., Каминный А.И., Титов В.Н., Кухарчук В.В., Малышев П.П. Оценка влияния аллельного варианта RS2230806 гена ABCA1 на гиполипидемические эффекты аторвастатина у больных с гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией. Атеросклероз. 2018. Т.14, №3, c.20-27. DOI: 10.15372/ATER20180303.
7. Кодылева Т.А., Кириллова А.О., Тыщик Е.А., Макаров В.В., Хромов А.В., Гущин В.А., Абубакиров А.Н., Ребриков Д.В., Сухих Г.Т. Эффективность создания делеции CCR5Ddelta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека. Вестник РГМУ. 2018; (4): 80–84. DOI: 10.24075/vrgmu.2018.052
8. Г.П. Смирнов, Т.А. Рожкова, М.Ю. Зубарева, Н.Б. Горнякова, Ю.А. Шувалова, А.И. Каминный, Д.В. Ребриков, В.А. Кошечкин, П.П. Малышев. Влияние аллельного варианта rs2230806 гена ABCA1 на фенотипические проявления семейной гиперхолестеринемии. Атеросклероз и дислипидемии. 2018. №4. с.36-42.