Врожденная (внутриутробная) пневмония (ВУП) развивается в результате внутриутробного или интранатального инфицирования плода [1]. По накопленным данным, при внутриутробном инфицировании плода причиной преждевременного разрыва плодных оболочек (ПРПО) при преждевременных родах (ПР) является не инфекционный агент сам по себе, а защитная реакция организма на него [2]. Происходят выработка медиаторов воспаления и запуск каскада иммунологических реакций [2, 3]. Таким образом, инфицирование плода может являться как причиной, так и следствием ПРПО [1]. Проблема ВУП обусловлена неоднозначностью этиологии и трудностью антенатальной диагностики, многофакторным воздействием инфекционного агента на плод. Также своевременную диагностику осложняет отсутствие четких корреляций между тяжестью инфекционно-воспалительного заболевания матери и степенью поражения плода [4]. Согласно современным клиническим рекомендациям, при ПРПО, произошедшем до 37-й недели, показана выжидательная тактика [5, 6]. Однако с увеличением длительности безводного промежутка (ДБВП) повышается риск таких осложнений, как хориоамнионит (ХА), преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты, выпадение или сдавление пуповины, послеродовые заболевания, требующие приема антибиотиков [7, 8]. При этом выбор в пользу активной тактики ведения повышает риск развития осложнений со стороны новорожденного, связанных с незрелостью: респираторного дистресс-синдрома, потребности в искусственной вентиляции легких, нахождения в отделении реанимации и интенсивной терапии, в результате чего повышаются перинатальная заболеваемость и смертность [9]. Выбор в пользу выжидательной тактики ведения может способствовать улучшению перинатальных исходов, но требует тщательного мониторирования состояния матери и плода [7]. В связи с этим требуются разработка и внедрение в практику метода диагностики, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, для проведения которого не требуется инвазивное вмешательство. Существующие в настоящее время методы, обладающие высокой диагностической точностью, требуют проведения амниоцентеза, который противопоказан при угрозе ПР. Ультразвуковая диагностика позволяет лишь предположить, но не является критерием постановки диагноза [10]. Как было указано выше, внутриутробное инфицирование плода может не давать клиническую симптоматику у беременной. В связи с чем нерешенной задачей остается своевременная диагностика ВУП плода при угрозе ПР и выжидательной тактике в III триместре беременности. В 2012 г. Титовым В.Ю., Осиповым А.Н. и соавт. предложен метод ранней диагностики воспалительных процессов, основанный на регистрации содержания нитрита (NO2–) и нетиолатных нитрозосоединений (RNO) в плазме крови при помощи ранее запатентованного ферментного сенсора (патент РФ № 2461831) [11]. Эти вещества являются продуктами взаимодействия супероксидного аниона, продуцируемого активированными лейкоцитами, с содержащимся в плазме депонированным оксидом азота [12]. При отсутствии воспалительного процесса вышеуказанные соединения находятся в крови в количестве менее 0,1 мкМ, так как неактивированные лейкоциты не продуцируют супероксид [13].
Ведущая роль ВУП в структуре неблагоприятных перинатальных исходов при ПР, высокий уровень инфицированности у беременных и родильниц обусловливают необходимость поиска достоверных методов ее диагностики.
В связи с этим целью нашего исследования явилось определение диагностической точности показателя NO2–+RNO в выявлении ВУП при ПРПО и ПР.
Наши основные гипотезы: 1) чувствительность и специфичность показателя NO2–+RNO в выявлении ВУП выше, чем у общепринятых маркеров воспаления (уровни лейкоцитов и C-реактивного белка (CРБ) в сыворотке крови, количество лейкоцитов во влагалищном и цервикальном содержимом); 2) значения показателя NO2–+RNO статистически значимо отличаются при ВУП по сравнению со значениями показателя у беременных с угрозой ПР (с наличием или отсутствием ПРПО) и без ВУП плода.
Материалы и методы
Проведено одномоментное (поперечное) исследование. У всех пациенток, госпитализированных в ГБУЗ «Центр Планирования семьи и репродукции» Департамента здравоохранения Москвы с 2021 по 2022 гг., проводилось одномоментное исследование уровня NO2–+RNO в венозной крови одновременно с обследованием по приказу №1130н (n=87) сразу при поступлении (до получения каких-либо препаратов). Проводили одномоментный забор материала для последующего исследования уровней NO2–+RNO в плазме крови, лейкоцитов и СРБ в сыворотке крови, для микроскопического и культурального исследований отделяемого половых органов.
Дополнительно проведена ретроспективная оценка после установления диагноза ВУП новорожденным из группы с ПРПО, свершившимся в сроках 220–366 недель гестации.
Деление на когорты проводилось с учетом срока гестации, наличия ПРПО и ВУП: группа Ia (группа контроля) – пациентки со сроком гестации ≥37 недель без ПРПО (n=21), Ib – срок гестации ≥37 недель + ПРПО (n=12), IIa – срок гестации 220–366 недель без ПРПО (n=12), IIb – срок гестации 220–366 недель + ПРПО (без ВУП новорожденного) (n=14), IIc – срок гестации 220–366 недель + ПРПО (с развитием ВУП у новорожденного) (n=28).
Критерии включения: информированное согласие на участие в исследовании, одноплодная беременность, для групп Ia и Ib – срок гестации ≥37 недель, для групп IIa, b, c – срок гестации 220–366 недель. Критерии исключения: антенатальная гибель и врожденные пороки развития у плода, антибактериальная терапия накануне госпитализации (7 дней и менее), воспалительные заболевания матери в стадии обострения. Наблюдение за пациентками проводилось с момента госпитализации до родоразрешения, за новорожденными – с рождения до выписки из стационара или перевода на второй этап выхаживания.
Согласно клиническим рекомендациям по ВУП, утвержденным Российской ассоциацией специалистов перинатальной медицины и Российским обществом неонатологов, ВУП диагностировалась при клинико-рентгенологических проявлениях в первые 72 ч жизни ребенка. Диагноз врожденной пневмонии устанавливался, если был выявлен хотя бы один основной и/или три (и более) вспомогательных диагностических признака [1].
Диагноз ПРПО устанавливали при положительном экспресс-тесте на плацентарный альфа-микроглобулин-1 в цервикальной слизи.
Регистрацию содержания NO2– и RNO в плазме крови проводили с помощью ферментного сенсора [11]. Для определения содержания NO2–+RNO у больных отбирали образцы крови в количестве 2 мл в пробирки с натрий-гепарином. Плазму получали путем центрифугирования образцов на центрифуге ЦУМ-1 при скорости 3000 оборотов в минуту в течение 3 мин. Супернатант отделяли от эритроцитов и использовали для определения содержания NO2–+RNO [11–13]. Определение активности каталазы осуществляли калориметрическим методом, основанным на контроле кинетики теплопродукции, сопровождающей ферментативное разложение перекиси водорода каталазой [12]. Отдельно стоит отметить, что сотрудники, которые определяли содержание NO2–+RNO, заранее не имели клинических данных пациентов и не знали об исходах новорожденных. В качестве референсного значения показателя выбрали 0,1 мкМ, превышение значения данного показателя определяли как наличие воспалительного процесса [13].
В нашем исследовании ни у кого из пациенток во время беременности не было подозрения на наличие внутриутробного инфицирования плода, не было показаний для проведения амниоцентеза (при наличии угрозы ПР проведение амниоцентеза противопоказано). Поэтому в качестве референсных тестов в исследовании использовали общепринятые в клинической практике маркеры воспаления: уровни лейкоцитов и CРБ в сыворотке крови, количество лейкоцитов во влагалищном и цервикальном содержимом. Определение данных параметров показано согласно Клиническим рекомендациям по ПР (2020) при ПРПО для своевременной диагностики септических осложнений [6].
Количественное определение СРБ in vitro в сыворотке крови человека проводили с использованием иммуноферментного метода, обозначаемого как метод «СРБ высокочувствительный» (или hsCRP ELISA). Данный тест основан на принципе твердофазного непрямого иммуноферментного анализа.
Учитывая то, что в настоящий момент нет рекомендаций по диагностике ВУП на антенатальном этапе, пороговые значения для сравнения чувствительности и специфичности индексного и референсного тестов определяли с помощью анализа ROC-кривых. Результаты представлены в разделе «Методы лабораторной диагностики и ВУП».
Дизайн исследования, проведение диагностических методов исследования, статистическая обработка данных одобрены локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (протокол № 213 от 13.12.2021).
Статистический анализ
Для статистического анализа и построения графиков использовали пакет статистических программ IBM SPSS Statistics 26.0 (IBM, США), StatTech v. 3.0.6 (ООО «Статтех», Россия) и MedCalc (MedCalc Software Ltd., США). Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью критерия хи-квадрат Пирсона (при значениях ожидаемого явления более 10), точного критерия Фишера (при значениях ожидаемого явления менее 10). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. При соответствии нормальному распределению количественные показатели описывались с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения данные представлены в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3). Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, при неравных дисперсиях выполнялось с помощью t-критерия Уэлча; при «ненормальном» распределении сравнение выполнялось с использованием U-критерия Манна–Уитни. Сравнение трех и более групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполнялось с применением однофакторного дисперсионного анализа, апостериорные сравнения проводились с помощью критерия Тьюки (при условии равенства дисперсий); при распределении, отличном от нормального, использовали критерий Краскела–Уоллиса, для апостериорного сравнения – критерий Данна с поправкой Холма. Оценка связи параметров проводилась с расчетом коэффициента корреляции Спирмена (rs), теснота связи оценивалась по шкале Чеддока. Для оценки диагностической значимости количественных признаков (чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная прогностическая ценность) при диагностике определенного исхода применялся метод анализа ROC-кривых. Разделяющее значение количественного признака в точке cut-off определялось по наивысшему значению индекса Юдена.
Критерием статистической значимости полученных результатов считали общепринятую в медицинской статистике величину p<0,05.
Параметры диагностической точности: чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная прогностическая значимость, а также 95% ДИ рассчитывали после составления таблицы сопряженности (с определением количества истинно и ложноположительных результатов, истинно и ложноотрицательных результатов) с помощью пакета программ MedCalc (MedCalc Software Ltd., США).
Расчет необходимого объема выборки проводился с использованием программы Epi Info на основании показателей размера популяции (по данным Федеральной службы государственной статистики, число преждевременных родов в 2021 г. – 59 500) и частоты встречаемости заболевания (согласно клиническим рекомендациям, ВУП диагностирована у 0,98% недоношенных новорожденных с массой тела при рождении 1000 г и более) (при заданной мощности исследования 95% и уровне значимости 0,05).
Результаты
Общая характеристика групп беременных и перинатальные исходы беременностей и родов
Общая характеристика пациенток по возрасту, индексу массы тела (ИМТ), сроку гестации на момент взятия пробы, акушерскому анамнезу, ДБВП, а также по показателям новорожденных представлена в таблице 1. Отдельно стоит отметить, что у пациенток из группы с ВУП статистически значимо чаще встречалась истмико-цервикальная недостаточность по сравнению с пациентками из других групп (p<0,001). Апостериорный анализ показал, что такие параметры, как ДБВП, вес и оценки по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, статистически значимо отличались в группе с ВУП. При этом разница в оценках по шкале Сильвермана не была статистически значимой между группами с наличием и отсутствием ВУП. При сравнении методов родоразрешения статистически значимая разница была выявлена только при сравнении пациенток из группы контроля (своевременные роды без ПРПО) и из группы с ПР и ВУП: 20 (69%) пациенток из группы контроля родили через естественные родовые пути, у 12 (46,2%) пациенток из группы с ВУП было оперативное родоразрешение (экстренное кесарево сечение) (p=0,005).
Перинатальные исходы новорожденных представлены в таблице 2. В группе своевременных родов большинство детей родились здоровыми, без перинатальных осложнений: 66,67 и 75% при отсутствии и наличии ПРПО соответственно. Остальные дети родились без признаков ВУП. В группе ПР без ПРПО все осложнения связаны с незрелостью легочной ткани. Только у 1 из 42 пациенток с ПРПО родился здоровый ребенок, не нуждавшийся в дополнительной респираторной поддержке и дальнейшем переводе на второй этап выхаживания. Стоит отметить, что в таблице 2 описаны осложнения, выставленные в качестве основного диагноза, однако у большинства детей из группы с ПР наблюдалось сочетание осложнений, связанных с недоношенностью. В группе новорожденных с ВУП представлены осложнения, кроме самой пневмонии.
Методы лабораторной диагностики и ВУП
Данные, полученные с помощью различных лабораторных методов, представлены в таблице 3.
При выжидательной тактике у пациенток с ПРПО и угрозой ПР такие маркеры воспаления, как лейкоциты и CРБ в венозной крови, оценивали в динамике для исключения развития ХА. На основании изменения показателей в динамике были рассчитаны средние значения. Средние значения лейкоцитов (p1) и CРБ (p2) в венозной крови статистически значимо не отличались при отсутствии и наличии ВУП (p1=0,939; p2=0,136).
Значения уровней метаболитов оксида азота статистически значимо отличались как при сравнении групп с наличием и отсутствием ПРПО, так и при сравнении групп с наличием ВУП и с ПРПО без ВУП. Отдельно стоит отметить, что не было выявлено статистически значимой разницы при сравнении значений NO2– + RNO у пациенток с наличием ПРПО в зависимости от срока гестации.
Сопоставление значений метаболитов оксида азота и наличия ПРПО, ВУП и срока гестации представлены на рисунке 1.
Была установлена статистически значимая прямая корреляционная связь реализации ВУП у новорожденного с уровнем метаболитов оксида азота в венозной крови матери (rs=0,626; p<0,001). Выявленная связь имела заметную тесноту по шкале Чеддока.
Для определения порогового значения показателя метаболитов оксида азота для диагностики ВУП был проведен ROC-анализ. Площадь под ROC-кривой составила 0,961 (0,021) с 95% ДИ 0,920–1,000. Полученная модель была статистически значимой (p<0,001). Пороговое значение показателя NO2–+RNO в точке cut-off, которому соответствовало наивысшее значение индекса Юдена, составило 2,2 мкМ.
Дополнительно проведено определение пороговых значений маркеров воспаления, широко используемых в практике: количество лейкоцитов в венозной крови, в мазке отделяемого влагалища и цервикального канала, уровень СРБ. Объединенные результаты ROC-анализа представлены на рисунке 2. По результатам анализа ROC-кривых отмечено, что нет статистически значимой зависимости между ВУП и значениями показателей уровней лейкоцитов в венозной крови (p=0,978) и в отделяемом влагалища и цервикального канала (p=0,657). Модель зависимости показателей CРБ и ВУП была статистически значимой (p=0,052).
На основании полученных пороговых значений составлена таблица сопряженности с определением числа истинно и ложноположительных и истинно и ложноотрицательных результатов. С учетом полученных результатов определены показатели диагностической точности: чувствительноcть, специфичность, положительная прогностическая значимость (PPV) и негативная прогностическая значимость (NPV). Полученные результаты представлены в таблице 4.
PPV значения показателя NO2–+RNO для диагностики ВУП составила 85,2% (95% ДИ 68,77–93,76), NPV – 93,33% (95% ДИ 84,97–97,20).
Оценка показателей прогностической значимости положительных и отрицательных результатов для СРБ: PPV – 52,63% (95% ДИ 33,80−70,74), NPV – 75,0% (95% ДИ 68,79–80,33).
В нашем исследовании у пациенток с развитием ВУП (n=28) по результатам культурального исследования содержимого влагалища и цервикального канала статистически значимо чаще, чем в других группах, выявляли: Escherichia coli (p=0,0038; ОШ 2,93; 95% ДИ 1,41–6,06) и Candida albicans (p=0,0382; ОШ 1,05–4,83; 95% ДИ 1,05–4,83). Отдельно стоит отметить, что только у 1 пациентки, у новорожденного которой развилась ВУП, было выявлено доминирование Lactobacillus spp. Согласно полученным нами данным, преобладание Lactobacillus spp. в составе влагалищной микробиоты беременной снижает шансы развития ВУП новорожденного в 12,4 раза (p=0,001; ОШ 0,08; 95% ДИ 0,02–0,36).
Обсуждение
Учитывая существенное влияние ВУП на перинатальные исходы, не вызывает сомнений важность методов ее своевременной диагностики. Особый интерес представляет возможность диагностики на этапе беременности. При сравнении таких стандартных маркеров воспаления, как количество лейкоцитов в венозной крови и в отделяемом мочеполового тракта, нами не было выявлено статистически значимых различий между группами с наличием и отсутствием ВУП новорожденного.
Изменение значения показателя СРБ не обладало клинической значимостью. Аналогичные данные приводят Хамадьянов У.Р. и соавт. [14]; по мнению авторов, в настоящее время нет специфичных неинвазивных методов диагностики, позволяющих с высокой долей вероятности предположить наличие внутриутробного инфицирования плода, косвенные методы (ультразвуковое исследование и допплерография) позволяют поставить лишь предположительный диагноз.
Согласно клиническим рекомендациям по ПР (2020), при ПРПО рекомендовано исследование уровней лейкоцитов в крови и СРБ в сыворотке крови для своевременной диагностики септических осложнений [6]. В исследовании, на которое ссылаются авторы в данной рекомендации, проведен метаанализ (12 исследований, 3617 пациенток, 3628 детей). Только в одном исследовании авторы определяли уровень лейкоцитов в венозной крови; данный показатель использовали в качестве одного из критериев постановки диагноза ХА при наличии клинических симптомов развившегося воспаления [15]. По всей видимости, определение уровня лейкоцитов не обладает диагностической ценностью при отсутствии клинических проявлений у беременной, что сопоставимо с полученными нами данными.
В клинических рекомендациях по ПР указаны следующие параметры диагностической точности CРБ для диагностики септических осложнений: чувствительность – 68,7%, специфичность – 77,1% [6]. Указанная чувствительность недостаточно высока для показателя, направленного на профилактику и своевременное выявление инфицирования.
В проведенном исследовании была выявлена статистически значимая разница в уровне метаболитов оксида азота в венозной крови матери между группами с наличием и отсутствием ВУП. Значения NO2–+RNO были статистически значимо выше у пациенток с ПРПО, по сравнению с пациентками с целыми околоплодными водами; при этом не было значимой разницы показателя в зависимости от срока гестации. Изменения показателей метаболитов оксида азота, независимо от срока гестации, указывали на то, что данный маркер связан не с угрозой ПР в целом, а непосредственно с механизмами, которые лежат в основе патогенеза ПРПО. Указанное имеет большую практическую значимость в связи с тем, что в настоящее время имеются данные о незначительном количестве маркеров, которые изменяются в зависимости от наличия ПРПО, а не при ПР в целом. К таким маркерам относятся: нарушение соотношения матричных металлопротеиназ и тканеспецифических ингибиторов матричных металлопротеиназ в амниотической жидкости и концентрация 3-нитротирозина в плодных оболочках [16]. При этом эти маркеры требуют инвазивного вмешательства для их определения. Нами была показана высокая чувствительность (85,2%) и специфичность (93,33%) метода определения уровня метаболитов оксида азота в венозной крови матери для своевременной диагностики ВУП новорожденного.
Результаты, полученные нами при анализе культурального исследования содержимого влагалища и цервикального канала, сопоставимы с результатами Brown R.G. et al. (2019). Авторы показали, что преобладание Lactobacillus spp. после 24 недель снижает относительный риск развития ПРПО [3]. Также наши результаты схожи с результатами Szubert M. et al. (2021), которые в своем исследовании показали, что в группе с обильным ростом аэробных бактерий и грибов чаще наблюдались ПР и признаки перинатальной инфекции у новорожденных [17]. Горина К.А. и соавт. (2020) в своем исследовании показали, что у пациенток с ПР статистически значимо чаще выявляли условно-патогенные микроорганизмы факультативно-анаэробного происхождения – Staphylococcus aureus (р=0,0365) и/или Klebsiella pneumoniae (р=0,0217); при этом отмечали более скудный рост облигатных анаэробов – Bacteroides spp. (p=0,0416) [18].
Выводы
1. Метод определения метаболитов оксида азота в венозной крови матери обладает высокой диагностической точностью для своевременного выявления ВУП при ПР, осложнившихся ПРПО: PPV – 85,2% (95% ДИ 68,77–93,76), NPV – 93,33% (95% 84,97–97,20). Чувствительность и специфичность составили 85,2% (95% ДИ 66,27–95,81) и 93,33% (95% ДИ 83,8–98,15) соответственно.
2. Добавление определения NO2–+RNO в комплексную диагностику ВУП позволит повысить точность постановки диагноза, что будет способствовать оптимизации тактики ведения беременных с угрозой ПР и ПРПО и снижению неблагоприятных перинатальных исходов, ассоциированных с инфекцией.
